Biosenzor microfluidic impedimetric pe bază de grafenă verticală pentru monitorizarea nivelului plasmatic al unor compuși utilizați în tratamentul bolii neoplazice

Program PN III: Programul 2-Cresterea competitivitatii economiei romanesti prin cercetare, dezvoltare si inovare

Tip proiect: Proiect de Transfer la operatorul economic

Proiect finantat din bugetul de stat și cofinanțat de DDS Diagnostic

Autoritatea Contractantă: Unitatea Executivă pentru Finanțarea Învățământului
Superior, a Cercetării, Dezvoltării și Inovării
Contract Nr.69PTE/2022
Perioada: 2022-2024
Coordonator: DDS DIAGNOSTIC S.R.L Bucuresti
Director Proiect: Dr. Dana STAN
BUGET PROIECT
VALOARE TOTALA: 1.424.355,00 lei
Valoare buget: 1.193.105,00 lei
Valoare cofinantare: 231.250,00 lei

Scopul principal al proiectului

In cadrul acestui proiect se va dezvolta un senzor electrochimic funcționalizat cu grafenă verticală, integrat într-o platformă microfluidică, destinat detecției unor agenți antitumorali des utilizați în practica medicală. Senzorul va avea aplicații în medicina personalizată, mai exact în monitorizarea și adaptarea schemelor de tratament ale pacienților bolnavi de cancer.

Obiectivele generale ale proiectului sunt:
O1. Producerea unui prototip de senzor electrochimic microfluidic pe baza de grafenă verticală, pentru detecția cantitativă a ETO, BLE și CIS, cu scopul de a realiza scheme de tratament personalizate. Aceasta implică activități de cercetare industrială și dezvoltare tehnologică vizând proiectarea, modelarea, fabricarea și caracterizarea prototipului. Prin aceasta proiectul contribuie la racordarea cercetării aplicative şi a progresului tehnologic din România la evoluția şi cerinţele mediului socio-economic naţional şi international, prin creșterea gradului de integrare dintre cercetarea aplicativă și actul medical.
O2. Validarea tehnologiei de obținere a sistemului microfluidic prin integrarea expertizei și tehnologiilor dezvoltate de cei trei parteneri, demonstrarea eficienței de detecție a ETO, CIS și BLE și trecerea acestui dispozitiv medical la stadiul de maturitate tehnologică TRL 6. Astfel, propunerea de proiect contribuie la obiectivul de stimulare a creșterii cheltuielilor sectorului privat în CD, atât pentru propriile activităţi, cât şi pentru colaborarea cu organizaţiile de cercetare.
O3. Integrarea într-un sistem unitar tip test rapid bazat pe un sistem microfluic a rezultatelor cercetării din alte proiecte ale partenerilor, pentru a putea fi utilizat ca dispozitiv medical cu perspective reale de punere pe piață și astfel încât să se poată trece de la TRL 4 la TRL 6. Astfel, proiectul contribuie la întărirea capacităţii de inovare a întreprinderilor şi consolidarea contribuţiei acestora la crearea de noi produse (microbiosenzori pentru diagnostic in vitro)/ tehnologii (fabricare microbiosenzori) cu potențial de exploatare comercială pe piața internă şi internațională.
O4. Demonstrarea funcționalității sistemului microfluidic pentru scopul propus, prin colaborare directă cu partenerii instituționali, până la gradul de maturitate tehnologică corespondent TRL 6 și elaborarea unui algoritm de lucru cu valoare de metodă de detecție, care să permită în viitor dezvoltarea sistemului microfluidic către etape mai avansate de maturitate tehnologică și punerea pe piață a acestuia ca tehnologie comercială.
O5. Elaborarea documentației de prototip specifică firmei beneficiare și argumentarea investițiilor necesare implementării la scară productivă.

Consorțiu

Coordonator: S.C. DDS Diagnostic S.R.L.
Director de proiect: Dr. Dana Stan
Partener 1: Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Microtehnologie Bucuresti (IMT); Responsabil proiect: Dr. Marioara Avram
Partener 2: Universitatea din București; Responsabil proiect: Dr. Lavinia Ruță

Rezultate preconizate

Realizarea unui prototip de senzor impedimetric cu aplicații în medicina personalizată și eficientizarea schemelor de tratament ale pacienților afectați de cancer, care urmează chemo-terapie.

Se va realiza validarea tehnologiei și transferul tehnologic către DDS.

Se vor disemina rezultatele prin organizare workshop-uri, participări la conferințe de specialitate și publicare de articole în reviste științifice.

Etapa 1 (21.06.2022-31.12.2022)

Proiectarea sistemului microfluidic și modelarea proceselor tehnologice pentru producția senzorului (în curs):

• Stabilirea parametrilor de design ai sistemului microfluidic – parțial realizată,

• Design și sinteză nanocorpi (etapa in silico) – parțial realizată,

• Diseminare prin publicarea internațională a rezultatelor (s-a realizat și actualizat pagina web, s-au realizat 200 de pliante pe suport solid (parțial distribuite în zonele de interes) și un newsletter electronic, distribuit către 300 de adrese de e-mail din rețeaua partenerilor celor trei entități participante la implementarea proiectului).

Diseminarea rezultatelor prin participare la manifestări tehnico-științifice și publicații științifice:
1. Partenerul IMT a participat la conferința internațională CAS 2022, ediția a 45-a și a prezentat posterul “Chitosan-coated gold nanocomposites loading with cisplatin for potential use in cancer therapy”,
2. Coordonatorul DDS Diagnostic a participat la târgul internațional de dispozitive medicale “Medica 2023” – Dusseldorf și a prezentat posterul “Development of a vertical graphene sensor, based on a DNA-nanobody conjugate, for the quantitative detection of plasma antineoplastic drugs”,
3. Partenerul IMT a publicat articolul științific “Vertical Graphene-Based Biosensor for Tumor Cell Dielectric Signature Evaluation”, Micromachines (Basel), 2022 Oct 4;13(10):1671. doi: 10.3390/mi13101671. (IF 3.52 – WoS).

Livrabile:

• DLV A – Raport tehnic de proiectare (de etapă)
• DLV B – Raport tehnologic de fabricare senzori (de etapă)

Ambele livrabile sunt incluse în raportul științific și tehnic al etapei.

Etapa 2 (31.12.2022-30.12.2023)

Realizare platformă microfluidică cu senzor de grafenă verticală pentru detecția ETO/BLE/CIS

• Stabilirea parametrilor de design ai sistemului microfluidic – finalizat,

• Design și sinteză nanocorpi (etapa in silico) – finalizat,

• Designul sistemelor de cuplaj și bioconjugate,

• Proiectarea și modelarea proceselor tehnologice pentru realizarea sistemului,

• Servicii de audit tehnologic pentru faza de dezvoltare experimentală,

• Activități de transfer tehnologic,

• Activități de brevetare.

 

Diseminare prin publicarea internațională a rezultatelor (s-a actualizat pagina web și doua newslettere electronice, distribuit către 300 de adrese de e-mail din rețeaua partenerilor celor trei entități participante la implementarea proiectului).

Diseminarea rezultatelor prin participare la manifestări tehnico-științifice și publicații științifice:

1. Coordonatorul DDS Diagnostic a participat la „a XIV-a Conferința Națională a Asociației de Medicină de Laborator din România, cu participare internațională” si expozitie de specialitate in Medicina de Laborator cu stand expozitional si cu posterul: ‚Electrochemical biosensors for monitoring treatment with antineoplastic drugs” – 14-16 iunie 2023, Timisoara.

2. Coordonatorul DDS Diagnostic si partenerul Universitatea din Bucuresti au publicat articolul științific „Nanobodies as Diagnostic and Therapeutic Tools for Cardiovascular Diseases (CVDs)”. Bocancia-Mateescu, L.-A.; Stan, D.; Mirica, A.-C.; Ghita, M.G.; Stan, D.; Ruta, L.L. Pharmaceuticals 2023, 16, 863. https://doi.org/10.3390/ph16060863;

3. Coordonatorul DDS Diagnostic a depus Cerere de Brevet la OSIM – „Procedeu de obtinere biosenzor pentru detectia electrochimica a cisplatinei din probe de plasma artificiala” A/00283.

Etapa 3 (01/01/2024 - 20/06/2024)

Verificare funcțională și validare prototip platformă microfluidică cu senzor de grafenă verticală pentru detecția ETO/CIS/BLE

  • Integrarea sistemului microfluidic cu peptidă recombinantă de tip nanocorp și detecția imunospecifică (finalizat),
  • Demonstrare funcționalitate platformă microfluidică,
  • Elaborare Raportare științifică finală.

Diseminare: s-a actualizat pagina web și două newslettere electronice, distribuit către adrese de e-mail din rețeaua partenerilor celor trei entități participante la implementarea proiectului, prezentare rezultate pe canale social-media (facebook, blog).

  1. Coordonatorul DDS Diagnostic a participat la „a XV-a Conferință Națională a Asociației de Medicină de Laborator din România cu participare internațională și expozitie de specialitate in Medicina de Laborator” cu stand expozițional și cu posterul: "Electrochemical biosensor for monitoring oncological treatment with etopozide” – Eforie Nord, Romania, 15-17 mai 2024.

Rezultate 69PTE

Cel mai semnificativ rezultat obținut a fost platforma microfluidică cu senzori electrochimici integrați, ai căror electrozi de lucru sunt funcționalizați cu grafenă verticală, decorată cu nanoparticule de Au, ce poate detecta cu acuratețe și cuantifica cele 3 medicamente antineoplazice (cisplatina, bleomicina și etopozidul). De asemenea, pe parcursul derulării proiectului s-au publicat 2 articole științifice ISI și trimis spre publicare încă unul și s-au depus 3 cereri de brevet.

Implementarea proiectului NEOPLACIP a generat, pe lângă produsul propus și o serie de componente și tehnologii noi, precum:

  • Senzori funcționalizați cu grafenă verticală, decorată cu nanoparticule de Au
  • Sistem microfluidic
  • Noi tehnologii de funcționalizare pe bază de sonde ADN cu design original
  • Noi protocoale de design și sinteză de proteine recombinante (nanocorpi)
  • Senzor pentru detecția și cuantificarea cisplatinei în probe de plasmă, pe bază de albumină serică umană (HSA)
  • Senzor pentru detecția și cuantificarea bleomicinei pe bază de sondă ADN și albastru de metilen (MB)
  • Senzor pentru detecția și cuantificarea etopozidului obținut prin tehnica MIP, cu electropolimerizarea pirolului în prezența analitului țintă, excizarea și crearea de șabloane specifice moleculei de etopozid.

Prezentarea nivelului de maturitate tehnologică (TRL) la finalul proiectului:

A fost elaborat și validat în TRL 6 fluxul tehnologic pentru obținerea biosenzorului, care a avut în vedere bioconjugarea senzorilor pentru detecția moleculelor țintă (Cisplatina, Bleomicina și Etopozid). S-a realizat fișa de lot pentru fabricarea măștilor fotolitografice. În urma auditului tehnologic efectuat, privind validarea tehnologiei de realizare platformă microfluidică cu senzor de grafenă verticală pentru detecția ETO/BLE/CIS și a rezultatelor verificate se validează în TRL 6 tehnologia propusă aflată în faza de demonstrare. Se recomandă brevetarea tehnologiei și a topografiei microcipului obținut.

Publicații științifice în reviste cotate ISI

  1. Graphene-Based Biosensor for Tumor Cell Dielectric Signature Evaluation. Micromachines (Basel). 2022 Oct 4;13(10):1671. doi: 10.3390/mi13101671.
  2. Diagnostic and Therapeutic Tools for Cardiovascular Diseases (CVDs). Pharmaceuticals 2023, 16, 863. https://doi.org/10.3390/ph16060863
  3. Un articol trimis spre publicare la revista International Journal of Molecular Sciences, cu titlul „Screen-printed electrodes - a promising tool for antineoplastic drugs detection (cisplatin and bleomycin) in biological samples”

Comunicări la conferințe

  1. Chitosan-coated gold nanocomposites loading with cisplatin for potential use in cancer therapy, 2022 International Semiconductor Conference (CAS), Oct. 2022, pp. 227-230, doi: 10.1109/CAS56377.2022.9934545.
  2. Development of a vertical graphene sensor, based on a DNA-nanobody conjugate, for the quantitative detection of plasma antineoplastic drugs, https://www.medica-tradefair.com/, Duseldorff, 13-16 Nov 2022
  3. Ruță Lavinia Liliana, Yeast surface display platform for the selection of GFP and mCherry nanobodies, XXVII Biochemistry Congress, 10-13 Septembrie 2023, prezentare orală;
  4. Ileana C. Fărcășanu, XXVII Biochemistry Congress, 10-13 Septembrie 2023, Hexatriacontahexapeptides designed as metal-binding Tags-prezentare orală
  5. Andreea Cristina Mirică, Lorena Andreea Bocancia Mateescu, Sorin Mocanu, Dana Stan, Electrochemical biosensors for monitoring treatment with antineoplastic drugs, A-XIV-A Conferință Națională a asociației de medicină de laborator din România (cu participare internațională), 14-16 Iunie 2023, Timișoara - poster
  6. Eugen Chiriac, Cornel Voițincu, Marioara Avram, Corneliu Bălan, A Simplified Dielectrophoretic Device for Particle Manipulation and Separation, 46th International semiconductor conference CAS 2023, 11-13 Octombrie 2023 – poster
  7. Participare la a-XV-a Conferință Națională a Asociației de Medicină de Laborator din România, 15-17 Mai 2024, cu lucrarea tip poster intitulată “Electrochemical biosensor for monitoring oncological treatment with etoposide”
  8. Participarea la 48th Annual Conference on yeast, Smolenice, Slovacia, 14-17 mai 2024, cu următoarele lucrări:
  9. Selection of GFP and mCherry nanobodies using the YSD method, Ruta L., Farcasanu
  10. Exploring Metal-Binding Hexatriacontahexapeptide Tags for Protein Modification, Farcasanu I, Ruta L.

Cereri de brevet  

  1. Cerere de brevet cu numărul A/00283, din data de 07.06.2023, cu titlul: “Procedeu de obținere biosenzor pentru detecția electrochimică a cisplatinei din probe de plasmă artificială”.
  2. Patent No. RO136001/2023, „Electrochemical sensor based on vertical graphene for the detection of circulating tumor cells through electrochemical impedance spectroscopy”, Marioara Avram, Bianca Adiaconiță, Andrei Avram, Eugen Chiriac, Tiberiu Burinaru, Cătălin Mărculescu, https://bit.ly/47IzEZr
  3. Patent No. RO137622/2024, „Field effect transistor based on nanocrystalline graphite for the detection of circulating tumor cells”, Marioara Avram, Bianca Adiaconiță, Andrei Avram, Eugen Chiriac, Tiberiu Burinaru, Cătălin Mărculescu, https://bit.ly/41SGtWN