Biologie moleculară: ce este PCR şi cum ne ajută să stabilim diagnosticul?

Tehnicile bazate pe biologie moleculară permit cu mare acurateţe stabilirea unui diagnostic, detectând concentraţii extrem de scăzute ale unei molecule relevante pentru boală, care prin alte metode nu ar putea fi depistate. Adesea, implică identificarea materialului genetic, uman, bacterian, viral sau de alte surse, în funcţie de analiza de laborator efectuată.

La baza majorităţii metodelor de diagnostic prin biologie moleculară se află PCR. Polymerase chain reaction, pe scurt PCR, implică multiplicarea moleculelor de acizi nucleici (ADN sau ARN). Creşterea in vitro a numărului de molecule de interes prezente într-o probă clinică ne permite să realizăm mai uşor detecţia acestora.

Metoda PCR a fost dezvoltată de Kary Mullis în anul 1985, realizare pentru care i-a fost acordat premiul Nobel în 1993. La momentul respectiv, etapele se realizau manual, iar metoda era foarte laborioasă. În prezent însă, există echipamente automatizate, iar procesarea manuală este minimă. Dezvoltarea PCR a reprezentat unul dintre cele mai mari progrese realizate vreodată. Disponibilitatea acestei metode a transformat cercetarea biomedicală şi diagnosticul de laborator, devenind baza a numeroase alte metode care implică analiza acizilor nucleici.

PCR poate fi utilizat doar pentru amplificarea moleculelor de ADN sau ARN, ca etapă în cadrul altor proceduri de diagnostic, cum ar fi secvenţierea. Secvenţierea presupune descifrarea întregii structuri a unei secvenţe ADN sau ARN de interes. PCR, însă, nu reprezintă doar o etapă în cadrul altor metode de diagnostic, ci poate reprezenta o modalitate completă de a stabili diagnosticul.

Cum funcţionează PCR?

Pentru a înţelege cum se realizează multiplicarea moleculelor de ADN sau ARN prin PCR trebuie cunoscută structura acestora. Acizii nucleici sunt compuşi prin înşiruirea a 4 tipuri de molecule numite nucleotide. Dintre acestea, 3 sunt comune pentru ADN şi ARN, iar a 4-a este diferită. Înşiruirea celor 4 tipuri de nucleotide într-o anumită succesiune formează o catenă de acid nucleic. Depistarea ordinii în care acestea se succed în structura ADN-ului sau ARN-ului de interes reprezintă secvenţierea.

Cele 4 tipuri de nucleotide sunt complementare între ele două câte două şi se pot asocia, astfel că dacă avem o anumită catenă de acid nucleic, o altă catenă formată prin înşiruirea nucleotidelor complementare corespunzătoare secvenţei acesteia se va asocia cu aceasta, formând o moleculă bicatenară de ADN sau ARN. La creşterea temperaturii, cele două catene complementare se separă.

În natură, materialul genetic al organismelor poate fi de tip ADN sau ARN, monocatenar sau bicatenar. În timp ce informaţia genetică la om este stocată în molecule de ADN bicatenare, virusurile pot să prezinte material genetic sub oricare dintre formele menţionate anterior. În organismele vii, multiplicarea moleculelor de acizi nucleici se realizează cu ajutorul unor enzime specifice, care pot adăuga nucleotide una după alta, pornind de la o catenă matriţă complementară.

PCR mimează ceea ce se întâmplă în natură, utilizând structura acizilor nucleici şi procesele biologice în care aceştia sunt implicaţi pentru a realiza o multiplicare eficientă şi cât mai rapidă a moleculelor de ADN şi ARN în laborator. Pe scurt, cele două catene de acid nucleic sunt separate prin încălzire, urmând ca, prin scăderea temperaturii, scurte molecule complementare cu capetele secvenţelor care trebuie amplificate să se ataşeze la acestea. Aceste structuri sunt numite primeri. Pornind de la primeri, care flanchează secvenţa de interes, se utilizează o enzimă care adaugă nucleotidă după nucleotidă pentru a sintetiza catena complementară celei iniţiale. Apoi, se creşte temperatura, compusul bicatenar se separă. Procesul acesta se repetă de 30-40 de ori (cicluri de amplificare), acumulându-se o multitudine de copii ale secvenţei de acid nucleic pe care o căutăm pentru procedura de diagnostic.

Care sunt cele mai utilizate tipuri de PCR?

Etapele menţionate mai sus constituie PCR convenţional, de bază, care a fost adaptat pentru a fi utilizat în variate aplicaţii. PCR de tip real-time utilizează markeri fluorescenţi, care emit semnal detectabil direct proporţional cu cantitatea de acid nucleic acumulată cu fiecare ciclu de  amplificare. Această metodă permite vizualizarea în timp real a detecţiei, precum şi stabilirea cantităţii în care se află secvenţa de interes în probă.

PCR multiplex presupune detecţia simultană a mai multor secvenţe de interes într-o probă, prin utilizarea mai multor perechi de primeri, fiecare fiind specifică pentru o anumită secvenţă pe care ne dorim să o depistăm. Pot fi mai multe gene ale aceluiaşi organism, spre exemplu, pentru a creşte sensibilitatea cu care depistăm un patogen, sau pot să fie secvenţe de la organisme diferite, aşa cum este cazul testelor de tip combo. Astfel, vedem simultan care dintre aceştia sunt prezenţi şi care nu în proba analizată.

PCR prin revers transcriere se realizează atunci când ne interesează secvenţe de tip ARN, deoarece etapele menţionate anterior funcţionează doar pentru acizi nucleici de tip ADN. Numeroşi patogeni, însă, au genom de tip ARN, cum este SARS-CoV-2. Pentru a putea realiza PCR pornind de la molecule de ARN, se realizează un prim pas adiţional, numit revers transcriere. În cadrul acestuia, se copiază catena de ARN în una complementară de ADN, aceasta din urmă fiind apoi amplificată prin PCR.

               Adesea, un kit de testare prin PCR poate să combine aceste metode. Spre exemplu, pentru a detecta SARS-CoV-2 utilizăm un PCR de tip real-time, care ne oferă rezultate cantitative, însă avem nevoie de revers transcriere deoarece virusul are genom ARN, iar sensibilitatea o creştem prin detecţia simultană a mai multor gene.

               Avantaje şi dezavantaje PCR

Metodele de diagnostic bazate pe PCR prezintă sensibilitate şi specificitate foarte ridicate, depistează acizi nucleici în cantităţi extrem de scăzute, care prin alte tehnici nu ar putea fi detectate. Adesea, PCR reprezintă metoda de referinţă pentru diagnostic. Pentru a realiza testarea prin PCR, sunt, însă, necesare numeroase resurse, fiind o metodă considerată mai scumpă, care utilizează echipamente speciale şi care necesită personal specializat. Pandemia COVID-19, însă, a stimulat producătorii de echipamente şi kituri să devină din ce în ce mai inovativi, astfel că în prezent sunt tot mai răspândite aparate şi reactivi care fac posibilă testarea PCR cu ajutorul dispozitivelor de tip point-of-care. Astfel, metoda PCR devine tot mai simplă, rapidă şi poate fi utilizată şi de persoane fără experienţă în biologie moleculară, obţinând rezultate cu precizie ridicată.

              În timpul pandemiei COVID-19, DDS Diagnostic a dezvoltat primul test de biologie moleculară românesc, care detectează cu înaltă precizie SARS-CoV-2 prin PCR, precum şi un kit pentru detecţia simultană a virusurilor gripale A şi B şi a SARS-CoV-2. Testul PCR DDS Diagnostic pentru depistarea infecţiilor cu SARS-CoV-2 a fost premiat la Romanian Healthcare Awards 2022, categoria Inovaţia Medicală a Anului.

Pentru mai multe informații despre trusele noastre PCR, ne puteți contacta la adresa de email sales@ddsdiagnostic.com sau prin telefon la 0722 114 850